documento 4.4.00 - ricerca di legionella in campioni ambientali

 

Ricerca di legionella in campioni ambientali 79

(Documento 4 aprile 2000 - Legionellosi)

1. - CAMPIONAMENTO.

Eseguire le operazioni osservando le precauzioni necessarie alla tutela della salute dell'operatore (mascherine, guanti, occhiali). Legionella sarà ricercata nell'ambiente idrico artificiale (impianti idrici, impianti di climatizzazione con refrigerazione ad acqua o ad aria, fontane decorative, idromassaggi, apparecchiature mediche per la respirazione assistita, stabilimenti termali) limitando i prelievi ai punti che maggiormente possono essere critici, sia in base alla struttura dell'impianto sia in funzione dei dati epidemiologici.

I campioni sono rappresentati da:

2. - MODALITA DI PRELIEVO.

2.1 - Acqua.

Il volume consigliabile è di almeno 1 litro, quando possibile. L'acqua sarà raccolta in recipienti sterili. Nel caso essa contenga cloro sarà opportuno aggiungere sodio tiosolfato ad una concentrazione finale di 0,01% (da una soluzione al 10% mettere 0,1 ml per 100 ml di acqua);

per la ricerca di Legionella in condizioni di utilizzo comune, prelevare, preferibilmente dal circuito dell'acqua calda, senza flambare al punto di sbocco e senza far scorrere precedentemente l'acqua;

per una ricerca quantitativa di Legionella nell'acqua all'interno dell'impianto, prelevare dopo aver fatto scorrere l'acqua per 5-10 minuti, flambando allo sbocco.

2.2 - Depositi.

Prelevare dallo scarico, oppure dal fondo della raccolta di acqua dopo aver eliminato l'acqua dall'alto. Raccogliere in recipienti sterili.

2.3 - Incrostazioni.

Prelevare da tubature e serbatoi, staccando meccanicamente il materiale depositatosi all'interno. Raccogliere in recipienti sterili.

2.4 - Tamponi.

Con un tampone sterile raccogliere il materiale depositato sulle superfici interne. Conservare il tampone in recipiente (provetta) con tappo a vite, contenente una piccola (2 ml) quantità dell'acqua dell'impianto.

2.5 - Filtri.

Il controllo deve essere eseguito su filtri utilizzati da diverso tempo, e non su quelli lavati o sostituiti di recente. Prelevare il filtro e conservarlo in un sacchetto di materiale plastico.

3. - TRASPORTO E CONSERVAZIONE.

I campioni devono essere conservati a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Vanno consegnati in tempo utile affinché l'analisi venga iniziata non oltre 24 ore dal prelievo. In caso di tempi più lunghi, conservare i campioni a 4°C e, comunque, per un periodo non superiore ai 7 giorni.

4. - PROTOCOLLO ANALITICO.

4.1 - Acqua.

Concentrare mediante filtrazione per membrana con porosità 0,2 µm. Talvolta può essere necessario utilizzare più membrane in successione. Prelevare la/le membrane con pinzette sterili e deporle in un contenitore sterile con tappo a vite contenente 10 ml della stessa acqua. Risospendere quanto depositato sulla membrana aiutandosi con una bacchetta a punta arrotondata oppure agitando energicamente su vortex.

Trattare parte della sospensione a 50°C per 30 minuti. Oppure, in alternativa, trattare con soluzione tamponata HCl-KCl a pH 2,2 (vedere la composizione nella nota dell'Allegato 1). In tale caso, centrifugare 10 ml della sospensione concentrata a 3000 r.p.m. per 20 minuti, rimuovere il sopranatante lasciandone 1 ml, aggiungere 9 ml della soluzione tamponata acida, mescolare bene e lasciare a temperatura ambiente per 5 minuti.

Piastrare 0,1 ml dei campioni trattati e non trattati su una/due piastre di terreno selettivo per Legionella.

Incubare a 36-37°C in aerobiosi, in ambiente umido, con 2,5% di C02, oppure in microaerofilia.

Conservare il campione concentrato a 4°C.

Esaminare giornalmente le piastre. Qualora il campione fosse molto contaminato (presenza di numerose colonie dopo 24-48 ore dalla semina), sarà necessario eseguire diluizioni in base 10 (10-1 e 10-2 ) con acqua distillata sterile del campione concentrato, eseguire un trattamento come indicato in precedenza, e piastrare 0,1 ml su terreno selettivo.

Eliminare una piastra come negativa solo dopo almeno 10 giorni di incubazione.

Nel caso di presenza di colonie di Legionella (Allegato 3) si potrà effettuare una valutazione quantitativa (unità formanti colonia/Litro, UFC/L) in base al numero di colonie per piastra ed alla concentrazione effettuata sul campione originale, tenendo conto anche delle eventuali diluizioni effettuate successivamente.

4.2 - Depositi.

Effettuare diluizioni in base 10 (10-1 e 10-2) con acqua distillata sterile e agitare bene. Trattare le sospensioni come descritto al punto 4.1. Piastrare su terreno selettivo solo le sospensioni trattate.

4.3 - Incrostazioni.

Frantumare e triturare le incrostazioni in mortaio o mixer sterili. Risospendere in acqua distillata sterile. Procedere come al punto 4.2. Piastrare su terreno selettivo il campione indiluito e diluito, senza e con trattamento.

4.4 - Tamponi.

Agitare il tampone nella provetta per rimuovere il materiale raccolto. Trattare parte del campione come descritto al punto 4.1. Piastrare su terreno selettivo sia le sospensioni non trattate che quelle trattate.

4.5 - Filtri.

Lavare il filtro o parte di esso in acqua distillata sterile e procedere come al punto 4.1.